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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

09-28

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  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,其原理:聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS),N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下,聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。

  SDS- polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)

  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由weber和Osborn进一步完善。

  聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP),N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下,聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合形成密度相同的短棒状复合物,不同分子量的蛋白质形成的复合物的长度不同,其长度与蛋白质分子量呈正相关,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,只是分子量的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么 SDS—PAGE后,就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成。

  (4)几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;

  (6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;

  (7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

  以往不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly,pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri s—HCl, pH8.8),两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl几乎全部解离成Cl一,两槽中的Gly(pI一6.0,pK a=9.7) 只有很少部分解离成Gly的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子存电泳时都向正极移动。Cl一速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly负离子最慢(尾随离子)。离子Cl一很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电化梯度最高,这时在电泳过程中形成的电化梯度的不连续性,导致蛋白质和G1y离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率。

  蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过9.0),使Gly解离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。此两项变化,使Gly的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中,按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相百分开。

  1.SDS与蛋白质的结合按质量成比例(即:1.4g SDS /g蛋白质),蛋白质含量不可以超标,否则SDS结合量不足。

  2.用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且sDs—PAGE 测定分子量有10%误差,不可完全信任。

  3.有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(Q一胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此,对于这一类蛋白质,SDS一聚内烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的相对分子量。

  4.有的蛋白质(如:电荷异常或结构异常的蛋白质;带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。

  5.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象,可能是SDS不纯引起。